Mikrokerntest

Genotoxizität und Genotoxizitätstests

Genotoxizität ist die Eigenschaft oder Wirkung von chemischen Stoffen oder Strahlungen, die mit den Chromosomen oder DNA-Proteinen in Zellen interagieren und Mutationen in diesen Strukturen verursachen. Selbst wenn ein chemischer Wirkstoff Gentoxizität aufweisen würde, würde diese Chemikalie allein nicht den Effekt verursachen. Wenn ein genotoxischer Stoff mit Körperzellen interagiert, hat dieser möglicherweise eine Toxizität, die zu Krebs oder anderen Krankheiten führen oder in einigen Fällen Erbkrankheiten auslösen kann, die über Generationen weitergegeben werden. Eine Eigenschaft, die eine irreversible, vererbbare Veränderung (Mutation) an der DNA hervorruft, wird als Mutagenität bezeichnet. Genotoxizität wird hingegen als weit gefasster Begriff verwendet, der auch die Eigenschaft beinhaltet, nicht vererbbare Veränderungen in der DNA und den Chromosomen zu induzieren.

Genotoxizitätstests (Mutagenitätstests) werden durchgeführt, um zu bewerten, ob ein chemischer Wirkstoff, der in einem Arzneimittel, einem Zusatzstoff, einer Agrarchemikalie oder einem allgemeinen chemischen Produkt verwendet wird, möglicherweise genotoxisch ist. Im Allgemeinen wird eine Prüfsubstanz einem Säugetier oder den kultivierten Zellen eines Säugetiers verabreicht und etwaige DNA-Schäden oder Chromosomenaberrationen aus der Wechselwirkung werden zur Bewertung der Toxizität untersucht. Das International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use (ICH) legt Richtlinien für pharmazeutische Vorschriften fest, darunter auch internationale Richtlinien für die Genotoxizitätsprüfung von Arzneimitteln. In der Regel werden Genotoxizitätstests durchgeführt und die Testergebnisse gemäß den ICH-Richtlinien bewertet. Diese Richtlinien werden von Expertenarbeitsgruppen diskutiert und überarbeitet, wobei die Meinungen der Zulassungsbehörden der Länder und Gebiete, die dem ICH angehören, berücksichtigt werden.

Mikrokerntest

Ein Mikrokerntest ist ein Genotoxizitätstest, der das Vorhandensein von Mikrokernen in Zellen, denen eine Testsubstanz (Chemikalie usw.) verabreicht wurde, und die Häufigkeit von Zellen mit Mikrokernen unter normalen Zellen bewertet. Er wird als Genotoxizitätstest verwendet, um Chromosomenaberrationen zu identifizieren. Ein Mikrokern ist ein kleiner Kern, der sich immer dann bildet, wenn ein Fragment eines Chromosoms während der Zellteilung nicht in einen der Tochterkerne eingebaut wird, und zwar als Folge einer chromosomalen Aberration, die durch eine Wechselwirkung mit einer Chemikalie ausgelöst wurde.
Es gibt zwei Gruppen von Mikrokerntests, je nachdem, auf welche Zielzellen die Testsubstanz abgegeben wird:

• In-vivo-Mikrokern-Assays: Mikrokern-Assays an Säugetieren, wie chinesische Hamster, Mäuse und anderen Nagetieren
• In-vitro-Mikrokern-Assays: Mikrokern-Assays an kultivierten Säugetierzellen, wie CHL/IU-Zellen (Lungenfibroblastenzellen des chinesischen Hamsters)

Das Prinzip der Mikrokernbildung beim Mikrokerntest

Die folgende Abbildung zeigt das Prinzip, wie sich bei einem Mikrokerntest Mikrokerne in Zellen bilden, wenn eine Testsubstanz genotoxisch ist.

• (1) Metaphase: Wenn die einem Säugetier oder den kultivierten Zellen eines Säugetiers verabreichte Testsubstanz mutagen ist, tritt eine Chromosomenaberration, wie z. B. ein Chromosomenbruch, auf.
• (2) Anaphase: Die Zellteilung schreitet fort, wobei das Chromosomenfragment in der Zelle verbleibt.
• (3) Telophase: Chromosomenfragmente, die nicht in die Tochterkerne eingebaut wurden, bleiben separat als Mikrokerne in den Tochterzellen.
• * Einige Mikrokerntests verwenden Cytochalasin B, um die Teilung in Tochterzellen während der Telophase zu verhindern. In solchen Fällen bilden sich während der Telophase zwei Kerne und zwei Mikrokerne im Inneren der Zelle.

Die Genotoxizität wird anhand von Chromosomenaberrationen beurteilt, indem die während der Telophase gebildeten Mikrokerne mit dem Mikroskop nachgewiesen werden. Für die mikroskopische Betrachtung wird in der Regel eine Fluoreszenzfärbung oder eine Giemsa-Färbung verwendet. Da die Größe von Mikrokernen etwa 1 μm beträgt, ist es schwierig, sie bei der Betrachtung mit einem Mikroskop mit hoher Vergrößerung unter zahlreichen normal geteilten Zellen zu finden und erfordert fachlich qualifizierte Anwender.

Comet-Assay

Ein Comet-Assay ist ein In-vivo-Assay, bei dem eine einzelne Zelle auf frühe DNA-Schäden untersucht wird, und wird auch als Einzelzell-Gelelektrophorese-Assay bezeichnet. Bei diesem Assay wird die isolierte Zellprobe in einem alkalischen Gel elektrophoretisch untersucht. Liegt eine DNA-Schädigung im Zellkern der Probenzelle vor, kann ein kometenähnliches Muster von DNA-Brüchen und Migration beobachtet werden. Der größte Unterschied zum in-vivo-Mikrokern-Assay ist die Möglichkeit, aufgrund der Verwendung einer einzelnen Zelle auf DNA-Schäden zu testen, ohne dass eine Zellteilung des untersuchten Zielorgans erforderlich ist. Ein weiteres Merkmal ist, dass ein Comet-Assay die Beurteilung mit einer Vielzahl von Organen und Geweben, einschließlich sich nicht teilender Zellen, ermöglicht. Comet-Assay hat eine hohe Sensitivität für genotoxische Karzinogene und eine hohe Spezifität für nicht karzinogene Substanzen.

Eine Kombination aus Comet-Assay und Mikrokerntest unter Verwendung desselben Tieres wird als sinnvolle Testmethode angesehen, mit der sowohl die Anzahl der für den Test verwendeten Tiere als auch die Testdauer reduziert werden kann.

Test auf Chromosomenaberrationen

Ein Chromosomenaberrationstest ist ein In-vitro-Assay, bei dem Chromosomenaberrationen durch Verabreichung einer Testsubstanz an kultivierte Säugetierzellen, wie z. B. CHL/IU in der Proliferationsphase, oder an eine Chromosomenprobe aus menschlichen Lymphozyten untersucht werden. Der größte Unterschied zu Mikrokerntests, die die Bildung von Mikrokernen in der Telophase untersuchen, besteht darin, dass Chromosomenaberrationstests anhand von Chromosomenproben in der Metaphase nach dem Vorhandensein von Chromosomenaberrationen suchen. Zu den Chromosomenaberrationen, die mit diesem Test nachgewiesen werden, gehören strukturelle Aberrationen, wie z. B. Deletionen (Bruch in einem der Chromatiden) und reziproke Translokationen (Segmente von zwei verschiedenen Chromosomen wurden ausgetauscht) und numerische Aberrationen, wie z. B. ein zusätzliches Chromosom oder das Fehlen eines Chromosoms.

Wird als Ergebnis des Chromosomenaberrationstests, der auf Chromosomenaberrationen in der Metaphase prüft, keine Mutagenität festgestellt, kann als sekundärer Screeningtest ein Mikrokerntest zur Untersuchung der Telophase durchgeführt werden.

Ames-Test

Der Ames-Test, auch Rückmutationstest an Bakterien genannt, ist ein Test zum Nachweis von genotoxischen Karzinogenen. Eine Mutationsinduktion wird festgestellt, wenn eine Testsubstanz einem autotrophen Mutantenstamm verabreicht wird, der selbst keine Aminosäuren produzieren kann, und die Mutagenität der Testsubstanz diesem ermöglicht, Kolonien zu bilden, indem er zu prototrophen Stämmen zurückkehrt, die Aminosäuren produzieren können. In einem In-vitro-Test mit Salmonella typhimurium oder Escherichia coli werden diese Bakterien auf einer weichen Agarplatte kultiviert, die keine Aminosäuren enthält. Die Kolonien werden gezählt, um anhand des Anteils der Platten mit Kolonien festzustellen, ob sie positiv oder negativ sind.

Bei Tests speziell zur Identifizierung genotoxischer Karzinogene kann bei positivem Ergebnis des Ames-Tests (Nachweis von Genmutationen) ein In-vivo-Mikrokerntest als sekundärer Screening-Test verwendet werden.

Betrachtung von Mikrokernen mit dem Fluoreszenzmikroskop BZ-X800

Das kompakte Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 ermöglicht eine einfache mikroskopische Betrachtung von Genotoxizitätstests, z. B. Mikrokerntests. Die Bildzusammensetzungs-Funktion, die Bilder mit hoher Vergrößerung automatisch als zusammengesetzte Bilder erfassen kann, bietet problemlos hochauflösende Bilder über ein großes Sichtfeld. Mit nur einem Klick auf das Navigationsbild auf dem Monitor kann der Anwender die Bereiche, die er sehen möchte, einfach in einem vergrößerten oder breiten Sichtfeld anzeigen lassen und auf diese Weise Mikrokerne schnell entdecken und betrachten.
Die maskierte Messfunktion und die Funktion zur Spezifikation der Zielobjektgröße der hybriden Zellzählung können Mikrokerne leicht extrahieren und quantifizieren, was nicht nur den Arbeitsaufwand reduziert, sondern auch eine deutlich schnellere Erfassung der Testergebnisse ermöglicht.
Die im BZ-X800 verwendete hochempfindliche, gekühlte CCD-S/W-Kamera ist optimal für die hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie geeignet und kann für optimale Hellfeldbetrachtung schnell in den Farbbetrachtungsmodus umgeschaltet werden. Dadurch unterstützt das BZ-X800 eine Vielzahl von Tests, darunter Mikrokerntests, Comet-Assays oder Genotoxizitätstests. Das BZ-X800 reduziert die Kosten und den Platzbedarf für Geräte im Labor und kann dank seiner eingebauten Dunkelkammer auch in einer hellen Umgebung eingesetzt werden, was eine flexible Installation und Nutzung ermöglicht.