Betrachtung und quantitative Analyse in der mikrobiologischen Prüfung

Mikrobiologische Prüfung von Lebensmitteln und ihr Zweck

Die mikrobiologische Prüfung von Lebensmitteln wird von Lebensmittelunternehmen zum Zweck der Sicherstellung der Lebensmittelsicherheit durchgeführt, insbesondere zur Untersuchung der Keimzahl auf das Vorhandensein von Bakterien oder Pilzen, die für Lebensmittelvergiftungen verantwortlich sind, und zur Beurteilung des Hygienestatus.
Die mikrobiologische Prüfung ist durch Normen und Richtlinien geregelt und Lebensmittelunternehmen sind verpflichtet, die Lebensmittelsicherheit in der gesamten Lebensmittelkette – von der Beschaffung der Rohstoffe über die Herstellung, den Transport und die Lagerung – durch Untersuchungen gemäß den geltenden Normen zu gewährleisten und zu überprüfen.
Während der Produktherstellung werden Hygienekontrollen und Qualitäts-/Sicherheitsbewertungen durchgeführt, um Problemen vorzubeugen. Zusätzlich werden bei Beschwerden von Verbrauchern nach der Auslieferung oder bei einem Vorfall mit Lebensmittelvergiftung, welche vermutlich durch hergestellte Lebensmittel verursacht wurde, die verbleibenden Lebensmittel, Zutaten, Kochgeräte und Werkzeuge, die für die Herstellung verwendet wurden, sowie die Einrichtungen mit Tupfern und Proben untersucht, um die Ursache des Vorfalls zu ermitteln und eine Wiederholung zu verhindern.

Differential-Interferenz-Kontrast-Betrachtung (DIK)

Was ist eine Differential-Interferenz-Kontrast-Betrachtung?

Die Differential-Interferenz-Kontrast-Betrachtung (DIK) ist eine Methode zur Betrachtung von ungefärbten, transparenten Proben unter Verwendung von optischen Wegdifferenzen. Wenn z. B. Licht durch eine transparente mikrobiologische Probe fällt, unterscheidet sich die Strecke, die das durchlässige Licht zurücklegt (optischer Weg), je nach Unterschied in der Dicke und dem Brechungsindex des spezifischen Teils der Probe. Dies wird als optische Wegdifferenz bezeichnet. Dadurch wird ein Kontrast entsprechend dem Dickengradienten der Probe erzeugt, wodurch ein dreidimensionales Bild entsteht. Die Schatten (Kontrast) haben eine Direktionalität, die für die Betrachtung fein eingestellt werden kann.

Mechanismus und Funktionsprinzip der DIK-Betrachtung

Ein DIK-Mikroskop ist sowohl auf der Kondensor- als auch auf der Objektivseite mit einem DIK-Prisma (Differential-Interferenz-Kontrast) ausgestattet. Polarisationsplatten sind an der Außenseite des DIK-Prismas angeordnet, sowohl auf der Seite des Kondensors als auch auf der Seite des Objektivs, und werden als Polarisator bzw. Analysator bezeichnet. Das von der Lichtquelle abgestrahlte Licht wird beim Durchgang durch den Polarisator polarisiert (Licht, das nur in eine Richtung schwingt). Das polarisierte Licht verzweigt sich in zwei Strahlen mit oszillierendem, polarisiertem Licht durch das kondensorseitige DIK-Prisma. Diese Strahlen sind meist parallel, wenn sie auf die Probe emittiert werden. Das polarisierte Licht, das den dicken Teil der Probe passiert hat, und das polarisierte Licht, das andere Teile passiert hat, weise eine optische Wegdifferenz auf. Die beiden Strahlen des polarisierten Lichts, die die Probe passiert haben, treffen sich am DIK-Prisma auf der Seite des Objektivs und durchlaufen den Analysator. Mit einem DIK-Mikroskop können Sie die Interferenz, die durch die optische Wegdifferenz der beiden polarisierten Strahlen entsteht, als Hell-Dunkel-Kontrast betrachten.

Vorsichtsmaßnahmen für die DIK-Betrachtung

Wenn Licht auf einen Kunststoffbehälter trifft, polarisiert sich das Licht im Behälter. Daher müssen Sie für die DIK-Betrachtung einen Glasbehälter verwenden. Kontrast wird auch durch Fremdkörper auf der Probe oder dem Objektiv erzeugt, was zu Rauschen führt, daher müssen Verunreinigungen vor der Betrachtung entfernt werden. Kontraste erscheinen im Betrachtungsbild in einer bestimmten Richtung, was bedeutet, dass es in manchen Fällen wichtig ist, den Objekttisch zusammen mit der Probe zu drehen, um die Richtung des Kontrasts zu ändern.

Phasenkontrastbetrachtung

Was ist Phasenkontrastbetrachtung?

Die Phasenkontrastbetrachtung ist eine Betrachtungsmethode, die die Phasenverschiebung zwischen gebeugtem Licht* und direktem Licht nutzt, die auftritt, wenn das Licht der Lichtquelle die Probe durchläuft. Die Umwandlung dieses Phasenkontrasts (optische Wegdifferenz) in einen Hell-Dunkel-Kontrast ermöglicht die Betrachtung von transparenten Proben, wie z. B. ungefärbten Mikroorganismen.

Mechanismus und Funktionsprinzip der Phasenkontrastbetrachtung

Mikroskope, die eine Phasenkontrastbetrachtung bieten, haben eine Phasenplatte und einen Ringspalt (Ringblende) im optischen Weg. Dieser Ringspalt formt das Licht der Lichtquelle zu einem Lichtring. Das ringförmige Licht passiert die ringförmige Phasenplatte auf der Objektivseite durch den Kondensor und die Probe. Die Phasenplatte erzeugt eine Phasenverschiebung des Lichts, das durch die Probe läuft.
Wenn die Probe auf diesem optischen Weg platziert wird, wird das Licht, das durch die Probe fällt, aufgrund der Beugung* des Lichts in direktes Licht und gebeugtes Licht* aufgeteilt. Wenn diese beiden Lichtstrahlen mit unterschiedlichen Phasen durch die Phasenplatte des Objektivs laufen, verstärken oder schwächen sie sich gegenseitig aufgrund der Wellenlängeninterferenz. Bei der Phasenkontrastbetrachtung wird die Interferenz durch die Phasendifferenz als Kontrast zwischen Objektbild und Hintergrund sichtbar gemacht.

* Beugung: Da Licht als Welle auftritt, läuft ein Teil des Lichts nicht geradeaus, sondern umgeht das Hindernis, wenn es sich im optischen Weg befindet. Dies wird als gebeugtes Licht bezeichnet.

Vorsichtsmaßnahmen für die Phasenkontrastbetrachtung

Wenn die Mitte des Ringspalts falsch ausgerichtet ist, tritt das Ringlicht aus der Phasenplatte aus, wodurch die Phasenverschiebung des direkten Lichts geschwächt wird und somit der Kontrast schwächer wird. Wenn sich der Zustand des präparierten Objektträgers zwischen den Proben unterscheidet, muss zusätzlich bei jedem Probenwechsel eine Zentrierung des Ringspalts durchgeführt werden.

Gram-Färbung

Was ist eine Gram-Färbung?

Die Gram-Färbung ist eine Färbetechnik, die zum Nachweis und zur Identifizierung von klaren, farblosen Mikroorganismen und Bakterien verwendet wird. Im Gegensatz zu optischen Methoden wie der Differential-Interferenz-Kontrast-Betrachtung und der Phasenkontrastbetrachtung werden transparente Proben mit Reagenzien gefärbt oder entfärbt, um die Zellwandstruktur und die Bestandteile der Bakterien zu unterscheiden, was eine Identifizierung und Analyse anhand ihrer Farbe und Form ermöglicht.

Beispiel eines Gram-Färbeverfahrens

Drei typische Gram-Färbemethoden sind: Die modifizierte Methode von Hucker, die Favor-Methode (Nishioka-Methode) und die Methode von Bartholomew und Mittwer. Im Folgenden wird das Gram-Färbeverfahren anhand eines Beispiels für die mikrobiologische Prüfung von Lebensmitteln nach der modifizierten Methode von Hucker erläutert, die als Standardfärbemethode gilt.

Ausstreichung

Streichen Sie eine Reinkultur von Mikroorganismen auf einen Objektträger, der entfettet und mit sterilem gereinigtem Wasser beladen wurde. Nach der Lufttrocknung führen Sie den Objektträger mit der ausgestrichenen nach oben durch eine schwache Flamme (Hitzefixierung). Waschen Sie den Objektträger von der Rückseite (Wasserspülung). Eine weitere Möglichkeit, den Ausstrich auf dem Objektträger zu fixieren, ist die Alkoholfixierung, bei welcher der Objektträger nach dem Trocknen mit Methanol geflutet wird.

Färbung

Tragen Sie Kristallviolett (Primärfärbung) auf den Objektträger auf und spülen Sie den Objektträger ab. Tragen Sie dann Lugolsche Jodlösung auf den Ausstrich auf und spülen Sie erneut.

Entfärbung

Entfärben Sie mit 95-prozentigem Ethanol (oder Aceton). Spülen Sie beide Seiten des Objektträgers gründlich ab, damit kein Ethanol oder Aceton auf dem Ausstrich zurückbleibt.

Gegenfärbung und Trocknung

Führen Sie eine Gegenfärbung mit Safranin oder Carbol-Fuchsin durch und spülen Sie nochmals. Lassen Sie das Wasser vom Ausstrich ablaufen, tupfen Sie den Objektträger mit Haushaltspapier trocken und lassen Sie ihn vollständig an der Luft trocknen.

Mikroskopische Prüfung

Ölimmersionsobjektive werden üblicherweise für die Mikroskopie mit hoher Vergrößerung verwendet.

Mikroorganismen anhand von Färbbarkeit, Form und Morphologie identifizieren

Im Folgenden finden Sie Beispiele für die Klassifizierung und Identifizierung von Mikroorganismen und Bakterien anhand der Färbbarkeit, Form und Morphologie mit Hilfe der Gram-Färbung.

	Mikroorganismen/Bakterien	Klassifizierung/Identifizierung
Färbbarkeit	Gram-positive Bakterien	Blau gefärbt (Zellwände sind dick und neigen nicht zur Entfärbung)
	Gram-negative Bakterien	Rot gefärbt (Zellwände sind dünn und neigen zur Entfärbung)
Form, Morphologie usw.	Gram-positive Kokken	Staphylokokken (Bakterien, die sich in traubenförmigen Gruppen bilden), Streptokokken (Bakterien, die Ketten bilden) usw. Staphylococcus aureus ist ein typischer Erreger für Lebensmittelvergiftungen.
	Gram-positive Stäbchen	Corynebacterium (keulenförmige, palisadenförmige, V-förmige oder W-förmige Anordnung), Bacillus (erscheinen als dicke Quadrate oder Trapeze) usw. Clostridium perfringens, Bacillus cereus und Clostridium botulinum sind typische Erreger von Lebensmittelvergiftungen.
	Gram-negative Kokken	In vielen Fällen werden die ursächlichen Bakterien für Infektionskrankheiten aus Sputumproben bestimmt.
	Gram-negative Stäbchen	Typische Bakterien in dieser Klassifizierung sind Darmbakterien (z. B. Escherichia coli), die im Vergleich zu anderen Gram-negativen Stäbchen größer und an beiden Enden dunkler gefärbt sind, und nicht Glucose-fermentierende Bakterien (z. B. Pseudomonas aeruginosa), die dünn und relativ klein sind. Zu den verursachenden Bakterien für Lebensmittelvergiftungen gehören Vibrio parahaemolyticus, Salmonellen, Campylobacter, enterohämorrhagische E. coli, Shigella und Vibrio cholerae.

Vorsichtsmaßnahmen für die Gram-Färbung

Eine Überentfärbung oder andere Fehler bei der Entfärbung können zu einer falschen Färbungsdifferenzierung von Gram-positiven/negativen Bakterien führen, was zu falschen Assays führen kann. Außerdem liefert ein einzelnes Sichtfeld möglicherweise nicht genügend Informationen für eine korrekte Prüfung. Es ist wichtig, eine umfassende Beurteilung vorzunehmen, indem die Probe aus mehreren Sichtfeldern betrachtet und analysiert wird.

Mikrobiologische Prüfung und Untersuchung mit einem Fluoreszenzmikroskop

Im Allgemeinen zielt die mikrobiologische Prüfung von Lebensmitteln, Kosmetika und quasi-pharmazeutischen Produkten auf lebende Bakterien ab. Ein Fluoreszenzmikroskop, das eine Art biologisches Mikroskop ist, verwendet fluoreszierende Antikörper oder Proteine als Marker, die die Betrachtung lebender Mikroben ermöglichen, ohne deren Zellen oder Proteine zu beschädigen.
Das kompakte Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 von KEYENCE ermöglicht die färbungsfreie Betrachtung von Mikroben, wodurch sich nicht nur die Zeit für die Probenvorbereitung drastisch verkürzt, sondern auch jegliche Schädigung der Mikroben durch Färbung vermieden wird. Das BZ-X800 macht auch die Betrachtung, quantitative Analyse und Zeitserienmessung von Gram-gefärbten Mikroben ganz einfach. Insbesondere kann das BZ-X800 den Zeit- und Arbeitsaufwand in Fällen, in denen große Mengen umfassender Daten für eine Prüfung oder eine Auswertung benötigt werden, wie z. B. die Mikrobenzahl über mehrere im Laufe der Zeit gesammelte Bilder, erheblich reduzieren.
Für die Bewertung von Tensiden und Konservierungsstoffen in kosmetischen und quasi-pharmazeutischen Produkten sowie für Viabilitätsprüfungen, z. B. zur effektiven Zählung von Laktobazillen in Lebensmitteln, kann das BZ-X800 Zellmembranen mit Licht bestrahlen, um lebende Mikroben zu prüfen und tote Mikroben durch Helligkeitsveränderungen als rot darzustellen. Die Helligkeitsänderungen werden als Live-Zellen-Bildgebung (Zeitrafferbildgebung) dargestellt und aufgezeichnet und können zur Echtzeitbetrachtung und -messung zu jedem beliebigen Zeitpunkt verwendet werden.
Die Funktionen des BZ-X800 erleichtern nicht nur die quantitative Analyse und Bewertung von Lebensmitteln, Kosmetika und quasi-pharmazeutischen Produkten durch mikrobiologische Prüfungen, sondern ermöglichen auch die Aufnahme von leicht verständlichen Videos, die die Funktionsweise von Laktobazillen und Hefen in Lebensmitteln zeigen und als Werbemittel eingesetzt werden können, die den Verbraucher ansprechen.
Darüber hinaus kann das Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 die Dunkelkammer innerhalb seines Gehäuses zur Betrachtung und Analyse nutzen, sodass Sie keine separate Dunkelkammer vorbereiten müssen. Dies bietet zusätzlich Flexibilität beim Installationsort, wenn das Gerät für Inhouse-Prüfungen eingesetzt wird.

Grün

Lebende Bakterien

Rot

Tote Bakterien

Bildgebungsintervall

20 Sekunden

Bildgebungszeit

10 Minuten