Fluoreszenzbildgebung: Ursachen für Fehlschläge und Gegenmaßnahmen

Prüfen Sie, ob das verwendete Objektiv geeignet ist

Für die mikroskopische Betrachtung müssen Sie wissen, ob die Eigenschaften des Objektivs dem Betrachtungszweck entsprechen. Die numerische Apertur (NA) ist insbesondere für die Fluoreszenzbetrachtung wichtig. Eine größere NA sorgt für ein helleres Bild bei höherer Auflösung. Im Allgemeinen liefert eine größere NA Bilder mit höherer Auflösung und mehr Details. Gleichzeitig wird die Tiefenschärfe (Depth of Field; DOF) geringer, wodurch sich der Bereich, in dem das Ziel scharfgestellt ist, verkleinert. Neben NA und DOF müssen auch die Helligkeit des Objektivs und der Betrachtungsabstand berücksichtigt werden. Diese Merkmale weisen die in der folgenden Tabelle aufgeführten Korrelationen auf.

Die Objektive haben ihre jeweiligen Eigenschaften*³. Zusätzlich zu den oben genannten erfordern einige Objektive eine Deckglaskorrektur*¹ oder eine Korrekturringeinstellung*², und andere haben ein optisches System, das nur für eine bestimmte Betrachtungsmethode ausgelegt ist. Es ist wichtig, dass Sie ein geeignetes Objektiv verwenden, das zu Ihrer Betrachtungsmethode passt.

*1 Deckglaskorrektur:
Deckglaskorrekturobjektive werden mit einem Deckglaskorrekturwert eingestellt. Das Deckglas ist in der Regel 0,17 mm dick. Bei Kunststoffschalen ist ein 1,2 mm dickes Glas zu verwenden, bei Verwendung ohne Deckglas ein 0 mm dickes Glas.

*2 Korrekturringeinstellung:
Manche Objektive mit hoher Vergrößerung haben einen Korrekturring (der wie eine Skala aussieht) auf ihrem Gehäuse. Die Auflösung vervielfacht sich, wenn dieser Ring entsprechend der Deckglasdicke eingestellt wird. Überprüfen Sie unbedingt den Status des Korrekturrings.

*3 Eigenschaften des Objektivs:
Je nach Art der Betrachtung kann es erforderlich sein, ein bestimmtes Objektiv mit einem optischen System zu verwenden, das speziell für eine bestimmte Methode entwickelt wurde. Es gibt verschiedene andere Eigenschaften wie Phasenkontrast, differentieller Interferenzkontrast (DIC), Polarisation, Fluoreszenz und Ölimmersion. Überprüfen Sie den Objektivtyp.

Stellen Sie das Objektiv von geringer Vergrößerung auf hohe Vergrößerung ein

Positionieren Sie das Objektiv nahe an der Probe und bewegen Sie es dann von der Probe weg, um das Bild zu fokussieren

Verwenden Sie eine für die Betrachtung geeignete Kamera

Es gibt viele Arten von Kameras, aber hier werden die Eigenschaften von CCD-Kameras besprochen, die am häufigsten mit Fluoreszenzmikroskopen verwendet werden.
Bei der Fluoreszenzbetrachtung ist es wichtig, ein hohes Signal-Rausch-Verhältnis (Signal-to-Noise Ratio S/N) zu haben. Die folgende Tabelle zeigt, dass eine gekühlte CCD-Monochromkamera am besten geeignet ist.

*1 Sichtbares Licht:
Im Allgemeinen handelt es sich um Licht mit Wellenlängen im Bereich von etwa 400 nm bis 700 nm. Farbkameras geben Bilder auf die gleiche Weise wieder wie das menschliche Auge, d. h. Wellenlängen von 700 nm und mehr werden abgeschnitten. Daher ist es nicht möglich, Licht mit diesen Wellenlängen zu betrachten.

*2 Dunkelstrom und Kühlung:
Selbst wenn eine CCD-Kamera keinem Licht ausgesetzt ist, werden Dunkelstromsignale erzeugt, die unerwünschtes Rauschen in den Bildern verursachen. Ein CCD erwärmt sich bei längerer Belichtungszeit, wodurch das Rauschen zunimmt. Dieses Rauschen kann durch Kühlung der Kamera reduziert werden.

Verwenden Sie die Funktion zur Einstellung der Helligkeit

Es gibt verschiedene Funktionen zur Einstellung der Helligkeit, aber die wichtigsten Punkte in den allgemeinen Kameraeinstellungen sind die drei unten aufgeführten. Es ist wichtig, ihre Eigenschaften zu kennen, um diese verschiedenen Einstellungen je nach Situation effektiv nutzen zu können.

Belichtungszeit

Dies ist die Zeit, in der die Blende geöffnet ist. Je länger Sie diese Zeit einstellen, desto heller wird das Bild, da die Signale während der Belichtung gespeichert werden. Dadurch erhöht sich aber auch die Menge des durch Dunkelstrom verursachten Rauschens, das gespeichert wird.

Verstärkung

Diese Funktion verstärkt elektrisch das elektrische Signal, das an das CCD-Element angelegt wird. Da jedoch das Eingangssignal verstärkt wird, wird auch das Rauschen verstärkt. Der Verstärkungswert hat keinen Einfluss auf die Auflösung.

Binning

Diese Funktion betrachtet benachbarte Pixel virtuell als ein einziges Pixel, um die empfangene Signalmenge pro Pixel zu erhöhen. Die Bildauflösung nimmt ab, weil die Anzahl der Pixel praktisch abnimmt, aber das Rauschen nimmt nicht zu.

Stimmen Sie Fluoreszenzfilter und Reagenz aufeinander ab

Selbst helle Fluoreszenzsignale werden nicht betrachtet, wenn der Filter ein niedriges Durchlässigkeitsverhältnis hat. Es ist wichtig, einen Filter zu verwenden, der eine möglichst hohe Durchlässigkeit aufweist.
Der Fluoreszenzfilter setzt sich aus drei Komponenten zusammen: einem Anregungsfilter, einem Absorptionsfilter und einem dichroitischen Spiegel. Prüfen Sie, ob sich die Anregungsspektren des Anregungsfilters und des Reagenzes überschneiden und ob sich die Fluoreszenzspektren des Absorptionsfilters und des Reagenzes überschneiden. Wenn zum Beispiel 470/40 auf einem Filter steht, bedeutet dies, dass der Bereich 470 nm ±20 nm abgedeckt ist. Wenn es schwierig ist, die Übereinstimmung nur mit numerischen Werten nachzuvollziehen, sehen Sie sich die Spektraldaten des Reagenzes und der Filter an, um zu prüfen, ob sie übereinstimmen. Sie können die Spektraldaten von Reagenzien und Filtern auf den Websites ihrer Hersteller oder ähnlichen Quellen einsehen.

Wählen Sie ein geeignetes Objektiv

Wie bereits erwähnt, ist es möglich, bei schwachem Fluoreszenzsignal oder geringem Kontrast eine helle Betrachtung durchzuführen, indem man zu einem Objektiv mit hoher NA wechselt. Eine größere NA sorgt für ein helleres Fluoreszenzsignal bei der Betrachtung. Die NA nimmt mit einem Objektiv mit höherer Vergrößerung tendenziell zu. Wenn das S/N-Verhältnis nicht wie gewünscht zunimmt, kann dieses Problem durch eine höhere Vergrößerung des Objektivs gelöst werden.

Wählen Sie die Lichtquelle aus

Je nach Ihrer Lichtquelle erzeugen Sie möglicherweise nicht die Wellenlänge, die Sie betrachten möchten. Es ist wichtig, eine für die Betrachtung geeignete Lichtquelle zu verwenden. Prüfen Sie die von Ihnen verwendete Lichtquelle und bestimmen Sie ihre Eigenschaften.
Quecksilberdampflampen und Halogen-Metalldampflampen decken jeweils ein breites Spektrum an Wellenlängen von kurz bis lang ab. Laser- und LED-Lichtquellen hingegen erzeugen jeweils nur bestimmte Wellenlängen und werden daher in Kombination mit anderen Lichtquellen eingesetzt. Wenn das Signal nicht ausreichend leuchtet, überprüfen Sie die Spektraldaten der Wellenlängen des Reagenzes und der Lichtquelle.

Reduzieren Sie die Intensität des Anregungslichts

Wenn man die Intensität des Anregungslichts verringert, wird das Fluoreszenzsignal dunkler, sodass man die Verstärkung der Kamera erhöhen oder die Belichtungszeit verlängern muss. In beiden Fällen wird eine entsprechende Menge an Rauschen erzeugt, was zu einem geringeren S/N-Verhältnis führen kann.
Um Bilder mit einem hohen S/N-Verhältnis aufzunehmen und gleichzeitig Fotobleichung und Schäden zu reduzieren, ist es wichtig, eine Kamera mit einer möglichst hohen Empfindlichkeit zu verwenden.

Reduzieren Sie die Belichtungszeit des Anregungslichts

Um die Belichtungszeit des Anregungslichts zu reduzieren, müssen Sie einfach die Betriebszeit verkürzen. Sie müssen versuchen, die verschiedenen Zeiten zu reduzieren, wie z. B. die Zeit für das Fokussieren der Bilder, die Zeit für die Suche nach Signalen und die Zeit für die Einstellung der Belichtungszeit, indem Sie sich auf die grundlegenden Dinge konzentrieren.
Wenn Sie ein Mikroskop verwenden, bei dem Sie die Verschlussblende für das Anregungslicht manuell öffnen und schließen müssen, kann es passieren, dass Sie vergessen, die Verschlussblende zu schließen, sodass die Probe ständig dem Anregungslicht ausgesetzt ist, was zu Fotobleichung führt. Es ist außerdem wichtig, die Verschlussblende häufig zu schließen, wenn Sie die Aufnahme beenden oder die Betrachtung unterbrechen.