Kalzium-Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop

Analyse mit Kalzium-Bildgebung

In den letzten Jahren verwenden immer mehr Forscher ein Fluoreszenzmikroskop für die Kalzium-Bildgebung (Ca-Imaging).
Die Kalzium-Bildgebung ist eine Methode, bei der der Fluss von intrazellulärem Kalzium gemessen wird, um die Kalzium-Signale aktiver Neuronen direkt zu beobachten. Diese Methode ist in vielen Anwendungsbereichen wie z. B. der Erforschung von Gehirnzellen weit verbreitet.

Es ist bekannt, dass Kalzium für an Land lebende Wirbeltiere sehr wichtig ist. Kalzium spielt auch eine wichtige Rolle bei der Bildung von starken Zähnen, die den Wirbeltieren die Aufnahme einer Vielzahl von Pflanzen und Tieren ermöglichen. Darüber hinaus ist Kalzium an vielen Lebensvorgängen in Organismen beteiligt, wie beispielsweise die Sekretion von Hormonen und Neurotransmittern, die Kontraktion von Muskeln und die formbaren Veränderungen von Neuronen. Durch die Betrachtung der im Organismus aktiven Kalzium-Ionen-Konzentration von Neuronen ermöglicht die Kalzium-Bildgebung eine detaillierte Messung der Zellaktivitäten, an denen Kalzium-Ionen beteiligt sind.

Grundlagen der Kalzium-Bildgebung

Verwenden Sie bei der Durchführung der Kalzium-Bildgebung ein Fluoreszenzmikroskop und ein Fluoreszenz-Mikrotiterplatten-Lesegerät. Bringen Sie ein Protein, dessen Fluoreszenzintensität sich bei der Bindung mit Kalziumionen ändert, und einen Kalziumfluoreszenz-Indikator in die Zelle ein und verwenden Sie dann die Änderungen in der Fluoreszenzintensität zum Nachweis der Änderungen der Kalziumionenkonzentration.
Der Kalziumfluoreszenz-Indikator ist jedoch sehr schwach, daher muss dieser Indikator während der Betrachtung mit starkem Laserlicht angestrahlt werden und es entsteht die Problematik des Zellsterbens. Daher ging man bisher davon aus, dass eine erfolgreiche Kalzium-Bildgebung nicht einfach zu bewerkstelligen sei.

Herausforderungen bei der Kalzium-Bildgebung und entsprechende Gegenmaßnahmen

Zu den häufigsten Herausforderungen bei der Kalzium-Bildgebung gehören geschwächte Zelle, unfokussierte Aufnahmen und die Bewegung der Zelle aus dem Bildfeld. Häufig treten diese bei der Bildgebung lebender Zellen mit einem Fluoreszenzmikroskop auf.

Wenn Sie z. B. mit der Kalzium-Bildgebung beginnen und erst nach einiger Zeit den Zellzustand überprüfen, ist die Zelle möglicherweise geschwächt oder abgestorben.
Eine Hauptursache ist die durch das starke Anregungslicht verursachte Zellschädigung, auch Phototoxizität genannt.
Maßnahmen gegen dieses Problem sind unter anderem:

• Verwendung einer möglichst hochempfindlichen Kamera
• Verwendung von Gain und Binning
• Konfiguration der Aufnahmebedingungen, damit auch schwache Fluoreszenz erkannt werden kann
• Reduktion der Intensität des Anregungslichts so weit wie möglich
• Ausschalten des Anregungslichts, wenn keine Bilder aufgenommen werden

Darüber hinaus kann es bei der Kalzium-Bildgebung vorkommen, dass das Bild unscharf wird. Mögliche Ursachen dieses Phänomens sind die Bewegung der Zelle aufgrund von Temperaturdrift, falsche Einstellungen und insbesonders die vertikal Bewegung der Zelle während der Zellteilung. Die meisten Forscher, die Betrachtungen mit Fluoreszenzmikroskopen durchführen, kennen dieses Phänomen bereits.
Als Gegenmaßnahme kann die Autofokusfunktion oder die Z-Stapelfunktion verwendet werden, um zu verhindern, dass das Bild unscharf wird.

Betrachtung der Kalzium-Bildgebung

Was ist G-CaMP?

Hierbei handelt es sich um eine Art von Kalziumsensorprotein, das durch gentechnische Verbindung eines grün fluoreszierenden Proteins, eines Calmodulins und eines Myosin-Lichtkettenfragments gebildet wird. G-CaMP kann in Gene eingefügt werden, wodurch es möglich wird, durch Kombination mit einem für die Struktur oder Zelle des Versuchtieres spezifischen Promotor die Kalzium-Bildgebung nur auf einer gezielten Struktur oder einem gezielten Karzinom durchzuführen.