Betrachtung von Spheroiden und Organoiden

Was sind Sphäroide?

Sphäroide sind Zellaggregate, die durch Aggregation und Organisation tausender Zellen zu einer Kugel in einer 3D-Kultur erzeugt werden können. Sie sind dafür bekannt, dass sie über einen längeren Zeitraum höhere funktionelle Expressionsniveaus bieten als 2D-Zellkulturen. Da Sphäroide einen metabolischen Gradienten bilden, erzeugen sie eine heterogene Zellverteilung durch Wechselwirkungen zwischen Zellen und der extrazellulären Matrix (ECM) bzw. zwischen den Zellen selbst. Sphäroide können aus verschiedenen Zelltypen generiert werden, z. B. aus Nervengewebe, Embryoid Bodies, Hepatozyten, Tumorgewebe oder Mammazellen. Der Aufbau ist physiologisch ähnlich wie bei 2D-Zellkulturen und ermöglicht eine hochgradige Reproduktion verschiedener krankhafter Gewebezustände.
Wegen diesen Eigenschaften werden Sphäroide gerne für das Screening bei der Evaluierung von Medikamentenwirksamkeit und -toxizität ausgewählt. Die Forschung zur Transplantation von Sphäroiden in Patienten als Behandlung schreitet ebenfalls voran, und die Nützlichkeit von Sphäroiden bei der Behandlung von ischämischen Erkrankungen und Lebererkrankungen ist anerkannt.

Was sind Organoide?

Organoide sind weiterentwickelte Sphäroide, denen man Funktionen als spezifische Organe gegeben hat. Es ist nicht möglich, echte Organe zu kultivieren, weil es schwierig ist, sie kontinuierlich mit Nahrung zu versorgen. Organoide sind kleiner und einfacher, sodass sie gezüchtet werden können. Der Unterschied zwischen Organoiden und Sphäroiden besteht darin, dass Sphäroide Klumpen von 3D-gezüchteten Zellen sind, während Organoide komplexere Gewebe sind, die aus mehreren Zellen bestehen und wie ein Organ funktionieren.

Organoide werden für verschiedene Organe erforscht, z. B. für das Gehirn, das Rückenmark, die Lunge, die Nieren, den Magen und den Verdauungstrakt. Auch in der Krebsforschung können Organoide aus den Tumorzellen eines Patienten gebildet und dann als Zielmodell verwendet werden.

Kultivierung von Sphäroiden

Die übliche Kultivierungsmethode für Sphäroide ist die Monolayer-Kultivierung, bei der die Zellen auf einem flachen Monolayer gezüchtet werden. Da die proliferierten Zellen die gesamte Kulturfläche bedecken, wird das Wachstum gehemmt oder die Zellen sterben durch Kontakthemmung ab. Die Herstellung von In-vivo-Umgebungen ist auch aufgrund des geringen Verbindungsverhältnisses zwischen den Zellen, das durch flächiges Wachstum verursacht wird, schwierig. Durch 3D-Proliferation kultivierte Zellen behalten jedoch ihre Form in vivo bei. Das hohe Verbindungsverhältnis zwischen den Zellen ermöglicht die Kommunikation, und es sind Experimente ähnlich wie bei In-vivo-Umgebungen möglich. In Anbetracht der obigen Ausführungen ist eine vollständige Bewertung der Wirksamkeit von Medikamenten mit einschichtig kultivierten Zellen manchmal nicht möglich, was problematisch sein kann.

Generell sollten Sphäroide, die in 3D-Kulturen erzeugt werden, eine einheitliche Anzahl konstituierender Zellen, Größe und Form haben. Wichtig ist auch die Möglichkeit, große Mengen von Sphäroiden auf einfache Weise zu erzeugen.
Es gibt mehrere Methoden zur Herstellung von Sphäroiden. Zum einen die Methode mit nicht haftender Oberfläche, bei der nicht haftende Kulturplatten zur Zellkultivierung geschüttelt werden. Zum anderen die Hanging-Drop-Methode, bei der die Oberflächenspannung zur Zell-zu-Zell-Adhäsion genutzt wird. Sowie die Rotationsmethode, bei der die Kulturkammer gedreht wird. Im folgenden Abschnitt werden die drei derzeit am häufigsten verwendeten Kulturmethoden vorgestellt.

Zellkultivierung mit nicht klebender Oberfläche

Bei dieser Kulturmethode werden nicht haftende Kulturplatten verwendet. Diese nicht haftenden Kulturplatten bieten eine verbesserte Oberflächenhydrophilie für die Zellkultivierung. Zellen, die auf die nicht haftende Kulturplatte fallen, schwimmen im Medium und haften aneinander, um ein Sphäroid zu bilden. Die Platte kann auch geschüttelt werden, um die Kontaktwahrscheinlichkeit zwischen den Zellen zu erhöhen. Mit dieser Methode können, je nach Größe der Kulturplatte, große Mengen an Sphäroiden gleichzeitig erzeugt werden.

Hanging-Drop-Zellkultivierung

Bei dieser Methode werden suspendierte Zellen auf den Deckel der Kulturplatte getropft und die aufgrund der Oberflächenspannung entstehenden Tröpfchen zur Kultivierung genutzt. Da die Zellen durch die Schwerkraft nach unten gezogen werden, haften sie aneinander und bilden Sphäroide. Diese Methode ermöglicht es, Sphäroide mit einer einheitlichen Anzahl von Zellen zu erzeugen.

Rotierende Zellkultivierung

Bei dieser Methode wird die Kulturkammer gedreht, um Sphäroide zu erzeugen. Durch die Rotation der Kulturkammer kommen die suspendierten Zellen gleichmäßig miteinander in Kontakt, sodass Sphäroide entstehen, die in Zellzahl und Größe relativ einheitlich sind. Diese Methode wird auch für die Kultivierung großer Mengen von Sphäroiden immer beliebter.

Beispiel für die Betrachtung von Sphäroiden

Im folgenden Beispiel wird mit dem kompakten Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 von KEYENCE ein HEK293-Sphäroid betrachtet, das durch die Verwendung von Scale, einem Reagenz, das Gewebe transparent macht, geklärt wurde. Abgestorbene Zellen sind rot gefärbt und fluoreszieren, wodurch die Verteilung der abgestorbenen Zellen sowie deren Zu- und Abnahme bei veränderten Bedingungen betrachtet werden kann.

Da Sphäroide aus aggregierten Zellen bestehen, sind sie eher dick. Dennoch ermöglicht die Optische-Sectioning-Funktion der Modellreihe BZ eine klare Betrachtung ohne Beeinflussung durch Streulicht aus unscharfen Bereichen. Die folgende Abbildung zeigt zwei Bilder, eines ohne und eines mit optischem Sectioning. Das Bild mit optischem Sectioning ist deutlich klarer.