Eliminierung der Autofluoreszenzunschärfe bei Pflanzen

Prinzip der Autofluoreszenz

Autofluoreszenz ist die natürliche Emission von Licht, auch Photolumineszenz (PL) genannt, die durch bestimmte Zellstrukturen und -eigenschaften verursacht wird. Wenn ein Objekt Licht empfängt, absorbieren seine Moleküle Photonen (Licht) und regen die Elektronen an. Photolumineszenz ist Lichtemission, die auftritt, wenn die Elektronen in einen niedrigeren Energiezustand zurückkehren. Autofluoreszenz liegt vor, wenn Zellorganellen wie Mitochondrien und Lysosomen oder Bestandteile der extrazellulären Matrix wie Kollagen und Elastin, oder Isoalloxazinring-Flavin-haltige Verbindungen wie NADH und Riboflavin natürliches Anregungslicht emittieren. In Pflanzenzellen sind Chlorophyll, ein grünes Pigment, das bei der Photosynthese verwendet wird, und Lignin, das die Zellwände ausfüllt, typische Beispiele für Elemente, die Autofluoreszenz aufweisen.

Wellenlänge der Autofluoreszenz

Im Allgemeinen wird Autofluoreszenz beobachtet, wenn Zellstrukturen mit Licht, das eine Wellenlänge zwischen 350 und 500 nm hat, angeregt werden und Licht mit Wellenlängen von 350 bis 550 nm zurücksenden.
Zum Beispiel wird NADH, eine typische Flavinverbindung, die Autofluoreszenz emittiert, durch Licht im 340-nm-Wellenlängenbereich angeregt und emittiert blaue Autofluoreszenz bei Wellenlängen um 460 nm. Chlorophyll wiederum, das die Funktion hat, Energie aus dem von der Pflanze durch Photosynthese absorbierten Licht zu erzeugen, zeigt Autofluoreszenz bei einer Wellenlänge um 680 nm.
Die Kenntnis der Wellenlänge des Anregungslichts einer Substanz zusammen mit ihrer Empfindlichkeit darauf und der Wellenlänge ihrer Autofluoreszenz sind der Schlüssel zu einer klaren Betrachtung der Zielsubstanz und des Zielgewebes.

Herausforderungen bei der Fluoreszenzbetrachtung von Pflanzen

Bei der Betrachtung von mehrzelligen Organismen wie Pflanzen ist es üblich, die Zielzellen und -strukturen mit fluoreszierenden Proteinen selektiv zu markieren und die Ansicht zu vergrößern, um diese Zellen und Gewebe näher zu betrachten. Wenn die Signale der Zielzellen und des Proteins bei der Betrachtung einer Pflanze unter dem Fluoreszenzmikroskop jedoch schwach sind, kann die Autofluoreszenz ein Faktor sein, der ihre Unterscheidung verhindert. Besonders bei der Betrachtung von Pflanzenzellen gelten Chlorophyll und andere Substanzen, die Autofluoreszenz aufweisen, als eine der Hauptursachen für Fluoreszenzunschärfe.
Fluoreszenzunschärfe, die durch die Autofluoreszenz einer Pflanze entsteht, erschwert die Betrachtung der Zielsubstanz. Die Herausforderung besteht also darin, der Unschärfe entgegenzuwirken, um klare Bilder für eine einfachere Betrachtung und Analyse zu erhalten.

Maßnahmen gegen die Fluoreszenzunschärfe durch Autofluoreszenz

Die Verwendung von Filtern ist eine gängige Methode, um zu verhindern, dass die Autofluoreszenz des Chlorophylls die Betrachtung von Pflanzenzellen behindert.
Wie bereits erwähnt, wird die Autofluoreszenz von Chlorophyll in einem Wellenlängenbereich emittiert, der bei 680 nm seinen Höhepunkt erreicht. Die Fluoreszenzbetrachtung kann durch die Verwendung eines für das Wellenlängenband geeigneten Fluoreszenzfiltersatzes erreicht werden, um Licht mit einer Wellenlänge von ca. 680 nm zu eliminieren und so eine erfolgreiche Fluoreszenzbetrachtung frei von Effekten der Autofluoreszenz wie z. B. Fluoreszenzunschärfe zu gewährleisten.
Wenn die Wellenlänge der Autofluoreszenz, die die Fluoreszenzunschärfe verursacht, nicht identifiziert werden kann oder keine eindeutige Wellenlängencharakteristik aufweist, sollte zunächst der Wellenlängenbereich gefunden werden, der die Autofluoreszenz ausblendet. Dies geschiet indem verschiedene Wellenlängen mit einem Standard-Fluoreszenzfilter getestet werden und dann ein geeigneter Filter verwendet wird, um die Betrachtung der Zielsubstanz zu ermöglichen.

Herausforderungen und Anforderungen bei der Betrachtung von Pflanzen

Die Eliminierung der durch Autofluoreszenz verursachten Unschärfe mit Hilfe eines Filters erfordert Zeit und Mühe, um die zu eliminierenden Autofluoreszenz-Wellenlängen und die dazugehörigen Filter zu identifizieren. Bei der Betrachtung der intrazellulären Strukturen einer Pflanze lassen sich in einigen Fällen Proben präparieren. Eine solche Probenvorbereitung erfordert jedoch hohe Fachkompetenz und Erfahrung. Außerdem besteht bei der Präparation von Schnitten die Gefahr, dass durch die Anwendung mechanischer Kraft auf die Pflanze unbeabsichtigte Reaktionen hervorgerufen werden.
Die größte Herausforderung bei der Untersuchung von Pflanzen besteht darin, die Zellen und das Gewebe mit klaren, fluoreszenzunschärfefreien Bildern selektiv betrachten zu können und in der Lage zu sein, dreidimensionale Strukturen genau und effizient zu betrachten.

Klare, voll fokussierte Bilder ohne Fluoreszenzunschärfe

Das kompakte Fluoreszenzmikroskop BZ-X800 von KEYENCE ist mit der Sectioning-Funktion ausgestattet, mit der Fluoreszenzunschärfen optisch ohne den Einsatz von Lasern beseitigt und klare Bilder einfach aufgenommen werden können.
Die Sectioning-Funktion nutzt den optischen Sectioning-Algorithmus*, um Fluoreszenzunschärfen zu eliminieren, sodass nur klare Fluoreszenz von der Brennpunktposition übrig bleibt, was eine schnelle und einfache Aufnahme klarer Bilder ermöglicht. Zusätzlich kann das BZ-X800 durch die Aufnahme mehrerer Bilder in Z-Richtung während der Verwendung der Sectioning-Funktion genau nur die Fluoreszenzsignale aufnehmen, ohne von Fluoreszenzunschärfen in allen Höhen über die gesamte Tiefe der Probe betroffen zu sein. Aus diesen Bildern wählt das BZ-X800 nur die Bereiche aus, die am schärfsten sind, und kombiniert sie zu einem vollständig fokussierten Bild. Dies erspart dem Nutzer die Zeit und Mühe, den richtigen Filter für die zu eliminierende Wellenlänge zu finden und liefert ihm direkt ein klares Bild für die Betrachtung.

* Der optische Sectioning-Algorithmus verwendet strukturierte Beleuchtung, um die Analysebereiche abzuteilen (z-Sectioning). Anregungslicht aus einer Halogen-Metalldampflampe, das einen breiten Wellenlängenbereich vom UV- bis zum Nahinfrarotbereich aufweist, wird durch ein elektronisches Projektionselement geleitet, das das Licht in einem Gittermuster auf die Probe projiziert (strukturierte Beleuchtung). Das Gitter wird nur auf die fokussierten Bereiche der Probe projiziert. Das BZ-X800 nimmt mehrere Bilder auf, während es das Gitter in Z-Richtung bewegt. Indem es aus diesen Bildern nur die Bereiche extrahiert, auf die das Gitter projiziert ist, verhindert es den Effekt der Fluoreszenzunschärfe in vertikaler Richtung. Dieser Algorithmus erzeugt automatisch klare Bilder, die selektiv nur aus den Signalen der fokussierten Bereiche bestehen.

3D-Bildkonstruktion und flexible Betrachtung

Es ist schwierig, dreidimensionale Gewebestrukturen nur anhand mehrerer zweidimensionaler Bilder zu analysieren und zu bewerten.
Mit dem BZ-X800 wird nur ein einziger Klick benötigt, um ein 3D-Bild aus Z-Stapel-Bildern zu konstruieren, die an verschiedenen Punkten der Z-Achse mit konstantem Abstand aufgenommen wurden. Zusätzlich kann der Nutzer, während er die Probe auf dem Monitor betrachtet, Querschnitte des 3D-Bildes einfach mit der Computermaus drehen, vergrößern oder verkleinern.
Die 3D-Bilder sind unabhängig vom Blickwinkel vollständig fokussiert und unterstützen das genaue Verständnis von lokalisierten Fluoreszenzsignalen, ganz gleich, wie die Computermaus bewegt wird.

1. 

   Ohne Sectioning

3. 

   Mit Sectioning